Mikroplasty pod mikroskopem: Využití perspektivní FTIR-FPA technologie v praxi

V poslední době se MP stávají celosvětovým zdravotním a ekologickým problémem. Jedná se o polymerní částice, které jsou zpravidla definované rozměrem menším než 5 mm. Do životního prostředí se dostávají prostřednictvím lidské činnosti, a to především praním textilií, používáním výrobků pro osobní péči, nevhodným nakládáním s odpady, otěrem pneumatik a dalšími.  Ačkoliv o toxicitě samotných částic zatím nepanuje na akademické půdě názorová shoda, faktem je, že při své cestě životním prostředím mohou polymerní částice na svůj povrch adsorbovat a nakumulovat řadu dalších nebezpečných chemických látek. Může se jednat např. o těžké kovy a organické látky rozpuštěné ve vodě (příkladem mohou být polychlorované bifenyly). Takže i z tohoto důvodu je nutné této problematice věnovat zvýšenou pozornost [2, 3].

Obecně se při analýze mikroplastů uplatňují dva přístupy – analýza hmoty a analýza částic. První jmenovaná využívá např. pyrolýzu v kombinaci s GC-MS a dokáže dát přesnější výsledky o množství materiálu. Na druhou stranu nedokáže poskytnout poměrně důležitou informaci ohledně velikosti daných částic, což je jeden z důležitých parametrů pro odhalení zdroje, toxikologických rizik ad. Zejména z toho důvodu se tedy často setkáváme s technikami částicové analýzy, jako jsou optická mikroskopie, konvenční FTIR mikroskopie, Ramanova mikroskopie a další. Každá z těchto technik má však své výrazné limitace – zatímco u optické mikroskopie nejsme schopni určit typ polymeru, u Ramana se setkáváme s velmi špatnou selektivitou (zdaleka né každá částice je měřitelná) a u klasické FTIR mikroskopie zase disponuje pomalou rychlostí měření.

FTIR-FPA technika mění pravidla hry

V literatuře můžeme často dohledat FTIR-FPA techniku jako nejperspektivnější pro částicovou analýzu MP [4]. Zachovává veškeré výhody FTIR mikroskopie (nedestruktivnost, dobrá selektivita, spolehlivost měření, nízké provozní náklady) a potlačuje největší limitaci této techniky pro analýzu MP – umožňuje extrémně rychlé měření velkých ploch. FTIR-FPA technologie je zabudována do FTIR mikroskopů LUMOS II – viz obr. 1.

Obr. 1 - FTIR-FPA mikroskop LUMOS II (Bruker Optics), FPA detektor v horní protažené (stříbrné) části mikroskopu

Obr. 2 - Rozdílný princip FTIR mapování: Jednobodový a řádkový přístup, dosahující řádově max. desítek spekter/s vs. Focal Plane Array mapování dosahující 900+ spekter/s

Další výhoda FPA detektoru spočívá i ve vylepšení prostorového rozlišení mikroskopu, kdy se při transmisním měření uplatňovaném při analýze MP dostaneme na 5x5 µm/pixel – tj. jsme schopni zachytit částice do velikosti až 5 µm.

Při využití FTIR-FPA mikroskopie je potřeba počítat s několika aspekty. FPA detektor je nutné chladit kapalným dusíkem, kdy na jedno naplnění zásobní Dewarovy nádoby je spotřebován cca 1 l s typickou výdrží 8 hod nepřetržitého měření. V neposlední řadě je potřeba počítat s tím, že s FPA detektory generujeme velké množství dat. Ostatně každou vteřinu měříme 900 spekter a na nich simultánně probíhají matematické operace. Tomu je potřeba přizpůsobit řídící PC (s maximální možnou výkonností) i data management např. s využitím prostřednictvím chytrých datových úložišť typu NAS apod.

Měření pomocí FTIR-FPA mikroskopie lze dnes považovat za rutinní analýzu – veškerý postup je do značné míry optimalizovaný a dotažený. Pro analýzu se jeví jako nejvhodnější aluminové filtry (Al₂O₃), které mají potřebné optické vlastnosti (transmisní okno v rozsahu 4 000–1 250 cm^-1), dobré mechanické vlastnosti, dostatečně malé póry pro zachycení sledovaných částic a nízkou cenu. Po izolaci MP na filtr dojde k automatizovanému proměření pomocí ovládacího softwaru OPUS, který uživatele provede v rychlosti celou analýzou (od pořízení optického snímku, změření pozadí až po definování a proměření oblasti zájmu). Následné vyhodnocení je po snadném exportu dat provedeno v dedikovaném SW MP Finder od Purency. Tento software obsahuje dedikovanou databázi 21 nejčastějších polymerů a také vyhodnocovací algoritmus založený na strojovém učení. Díky tomuto algoritmu dokáže software v krátkém čase (jednotky až nižší desítky minut) vyhodnotit velké spektrální mapy čítající miliony spekter a uživateli vygenerovat přehlednou statistiku
částic – chemismus vztažený na velikost. Součástí vyhodnocení jsou i údaje o spolehlivosti stanovení pro každou částici. 

Jak izolovat mikroplasty z různých matric?

Jak již bylo řečeno, mikroplasty se vyskytují v mnoha složkách životního prostřední, včetně organismů, nevyjímaje lidské tělo. Pracoviště Výzkumného ústavu vodohospodářského T. G. Masaryka, v.v.i., (VÚV) v Brně se aktuálně zabývá stanovením mikroplastů ve vzorcích odpadních, povrchových a pitných vod, sedimentů, půd, vzduchu a v neposlední řadě ve vzorcích makrozoobentosu. Ke každému typu matrice se musí přistupovat individuálně s velkou mírou pečlivosti a preciznosti. Ačkoliv se objevují trendy směřující ke standardizaci postupů (norma ISO 24187:2023 EU – Principy pro analýzu mikroplastů), v současné době zatím stále neexistuje žádný schválený postup předúpravy vzorků.

Předcházejícím krokem před samotnou analýzou je odběr vzorku a jeho předúprava do vhodné izolované formy, ve které jsou eliminovány ostatní složky, které by mohly být nežádoucí z hlediska zkreslení výsledku.

V případě vzorků vody je primárním krokem odstranit organické znečištění. Tento proces se nejčastěji provádí pomocí roztoku peroxidu vodíku (H₂O₂), kdy je společně se vzorkem zahříván na specifickou teplotu, zpravidla okolo 40 až 50 °C. Při této teplotě je temperován v řádu několika hodin až několika dnů. Pokud je ve vzorku zastoupeno značné množství organické hmoty, k její eliminaci se využívá Fentonovo činidlo, směs heptahydrátu síranu železnatého a peroxidu vodíku. Při této aplikaci je nutné dbát zvýšené opatrnosti, zmíněná směs je vysoce reaktivní a exotermní, proto je zapotřebí vzorek chladit ledem, aby nedošlo k degradaci nebo změně struktury polymerů. Dalším krokem je odstranění anorganické složky, např. oxidu křemičitého. Tento krok je volitelný a využívá se pouze v případě, že je anorganická složka zastoupena natolik výrazně, že ovlivňuje měření. K tomuto kroku se využívá hustotní separace, nejčastěji chlorid zinečnatý. Na základě hustoty anorganické částice sedimentují ke dnu, zatímco polymery vzlínají k hladině. Tímto způsobem se separované mikroplasty kvantitativně odeberou k analýze [5].

Další sledovanou matricí jsou půdy a sedimenty. Po úspěšném odběru je potřeba vzorky usušit do stabilní hmotnosti. K tomu mohou sloužit sušárny a teplota nejčastěji do 40 °C. Další možnou alternativou je lyofilizace, neboli sušení mrazem, kde je nespornou výhodou narušení struktury agregátů půdy, což usnadní lepší odloučení polymerů od samotné matrice. Ovšem nevýhodou může být nízká pracovní teplota pod bodem skelného přechodu, čímž může dojít ke zvýšené křehkosti polymerů. Usušený vzorek je zapotřebí prosít a precizně zhomogenizovat. Tímto způsobem upravený vzorek se nejdříve eliminuje od anorganické složky pomocí již řečené hustotní separace a následně je nutné odstranit organickou část. Jako nejvhodnější oxidační činidlo pro odstranění organické hmoty je považován Fenton a peroxid vodíku [5, 6].

Neméně důležitou složkou životního prostředí je vzduch, který se zdá být nejméně probádaný z hlediska přítomnosti mikroplastů. Vzorky jsou nejčastěji odebírány na filtry ze skleněných vláken. Zakoncentrované nečistoty na filtrech je nutné převést do vodného prostředí, k tomu nám může pomoci ultrazvuk. Pro eliminaci organického a anorganického znečištění se nejčastěji aplikuje peroxid vodíku a chlorid zinečnatý [7].

Poslední zkoumanou skupinou jsou organismy ze společenství makrozoobentosu. Tito bezobratlí živočichové jsou vhodným indikátorem znečištění povrchových toků. Organismy jsou odebírány v tocích pomocí ruční bentosové sítě. Zachycené organismy jsou očištěny od zbytku substrátu, klasifikovány do jednotlivých skupin, změřeny, usušeny a zváženy. Pro zjištění kvantity zkonzumovaných mikroplastů ve sledovaných zástupcích makrozoobentosu je nutné použit peroxid vodíku a různé enzymy. Nejvíce osvědčený je enzym proteáza, ale v praxi se využívají i další, např. chitináza, lipáza, celuláza a další. U některých zástupců je nutné do procesu zařadit i hustotní separaci s chloridem zinečnatým.

Praktická ukázka analýzy a vyhodnocení reálného vzorku

Stanovení mikroplastů probíhá na technologii FTIR-FPA – mikroskopu LUMOS II od společnosti Bruker (instalovaný systém s uzavřeným vzorkovacím prostorem viz obr. 3). Měřící rozsah je nastaven na 4 000 až 1 250 cm^-1, 1 scan a rozlišení 8 cm^-1. Před samostatným měřením vzorku je nutné změřit background (čistý filtr bez přítomnosti částic). Měření probíhá v programu zvaném OPUS a vyhodnocení zajišťuje software Purency.

Obr. 3 –  FTIR-FPA mikroskop LUMOS II s uzavřeným vzorkovacím prostorem instalovaný na VUV

Vzorek odpadní vody z čistírny, zbavený organické i anorganické složky, byl za pomoci sestavy vakuové pumpy, odsávací baňky a zmenšeného typu nálevky (dosažení menšího filtračního koláče) převeden na aluminový filtr. Pro ukázku je na obr. 4 změřený celý filtr, jehož samotná analýza trvala cca 2 hodiny. Výsledkem tedy je, kolik mikroplastů se z čistírny dostává do recipientu a dalších složek životního prostředí. Objem vzorku byl 4 litry a bylo v něm identifikováno 3 255 částic různých druhů polymerů. Pokud by se dané množství přepočítalo na objem 1 000 litrů, počet mikroplastů by překročil hodnotu 813 000. Na obr. 5 jsou vyobrazené detekované částice polymerů v program Purency.

Obr. 4 - Vizuální snímek detekovaných částic u vzorku odebraného na odtoku z čistírny – Program OPUS

Obr. 5  Detekované částice u vzorku odebraného na odtoku z čistírny - Program Purency 

Statistika ze SW Purency hovoří následovně. Ve vzorku se vyskytovalo nejvíce částic polypropylenu, konkrétně 1 232. Dále v pořadí je polyamid (PA) – 865 částic a polyethylentereftalát (PET) – 392 částic. Ve vzorku bylo detekováno 1 195 částic polymerů, které měly velikost pouhý 1 px a plochu pod 29,17 µm². Počet a druh identifikovaných polymerů je na obr. 6. Na obr. 7 je k nahlédnutí tabulka s detekovanými polymery seřazenými dle velikosti. Počet detekovaných polymerů v závislosti na velikosti částic je zobrazený na obr. 8. Nejvíce zachycených částic bylo do velikosti 5 px.

Obr. 6 ,7 a 8– Přehled detekovaných polymerů v SW Purency/Přehled identifikovaných částic seřazených dle velikosti v SW Purency/Závislost počtu detekovaných polymerů na velikosti částic

Obr. 9 – Identifikované vlákno polyethylentereftalátu (PET) – OPUS (vlevo) a Purency (vpravo) 

Obr. 10 - Spektrum detekované částice polyethylentereftalátu (PET)

Kam směřují trendy?

Využití FTIR-FPA pro analýzu MP jde neustále vpřed a už v dnešní době mluvíme hned o několika jednotkách systémů instalovaných na našem území. SW i HW se neustále zdokonaluje za účelem dosažení plně rutinní analýzy. Současné trendy směřují k analýze a vyhodnocení celé kruhové plochy filtru, a to u několika filtrů zároveň. Tj. koncept je nechat přístroj měřit „přes noc“ a mít k dispozici proměřenou a vyhodnocenou sadu 3–4 filtrů. Velký progres lze s nástupem AI očekávat i ve způsobu vyhodnocení, kdy dochází k vývoji dalších vyhodnocovacích algoritmů a dedikovaných AI metod pro spolehlivou identifikaci částic na filtru. Jedním z řešených témat je také kvalita vizuálního obrazu, kdy uchycený filtr není zcela rovný (k okrajům je přítlakem mírně zvlněný) a velký snímek celého filtru je tak na okrajích rozostřený. Zde dochází k vývoji a implementaci funkcí pro automatické ostření a skládání VIS obrazu zaostřeného ve velké ploše.

Závěr

Problematika mikroplastů je v dnešní době široce diskutovaná a velmi aktuální. V řádcích výše jsme se pokusili shrnout, jaké jsou v dnešní době analytické možnosti a také, s jakou úpravou vzorků je potřeba počítat v případě různých matric.

Pracoviště Výzkumného ústavu vodohospodářského T. G. Masaryka, v.v.i., v Brně nyní aktivně pracuje na analýzách mikroplastů v různých matricích životního prostředí. Na příkladu vzorku odtoku z ČOV byla prezentována velmi perspektivní FTIR-FPA mikroskopie, jako aktuálně jediná technika, schopná podrobné a zodpovědné analýzy větších ploch s možností proměření každého bodu na filtru a zachycením i těch nejmenších částic. Zároveň je připravená pro práci v rutinním módu.

Autoři:

Ing. Roman JURNEČKA, Výzkumný ústav vodohospodářský T. G. Masaryka v.v.i., roman.jurnecka@vuv.cz, https://www.vuv.cz/

Ing. David MATOUŠEK, OPTIK INSTRUMENTS s.r.o., david.matousek@optikinstruments.cz, www.optikinstruments.cz

Sovisející přístroj:

Související aplikace:

Zdroje:

1. THOMPSON, Richard C.; OLSEN, Ylva; MITCHELL, Richard P.; DAVIS, Anthony; ROWLAND, Steven J. et al. Lost at Sea: Where Is All the Plastic? Online. Science. 2004, roč. 304, č. 5672, s. 838-838. ISSN 0036-8075. Dostupné z: https://doi.org/10.1126/science.1094559. [cit. 2024-05-13].
2. GHOSH, Shampa; SINHA, Jitendra Kumar; GHOSH, Soumya; VASHISTH, Kshitij; HAN, Sungsoo et al. Microplastics as an Emerging Threat to the Global Environment and Human Health. Online. Sustainability. 2023, roč. 15, č. 14. ISSN 2071-1050. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/su151410821. [cit. 2024-05-13].
3. LI, Yue; TAO, Le; WANG, Qiong; WANG, Fengbang; LI, Gang et al. Potential Health Impact of Microplastics: A Review of Environmental Distribution, Human Exposure, and Toxic Effects. Online. Environment & Health. 2023, roč. 1, č. 4, s. 249-257. ISSN 2833-8278. Dostupné z: https://doi.org/10.1021/envhealth.3c00052. [cit. 2024-05-13].
4. LÖDER, Martin Günter Joachim; KUCZERA, Mirco; MINTENIG, Svenja; LORENZ, Claudia a GERDTS, Gunnar. Focal plane array detector-based micro-Fourier-transform infrared imaging for the analysis of microplastics in environmental samples. Online. Environmental Chemistry. 2015, roč. 12, č. 5. ISSN 1448-2517. Dostupné z: https://doi.org/10.1071/EN14205. [cit. 2024-05-13].
5. RANI, Monika; DUCOLI, Serena; DEPERO, Laura Eleonora; PRICA, Miljana; TUBIĆ, Aleksandra et al. A Complete Guide to Extraction Methods of Microplastics from Complex Environmental Matrices. Online. Molecules. 2023, roč. 28, č. 15. ISSN 1420-3049. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/molecules28155710. [cit. 2024-05-13].
6. THOMAS, Daniela; SCHÜTZE, Berit; HEINZE, Wiebke Mareile a STEINMETZ, Zacharias. Sample Preparation Techniques for the Analysis of Microplastics in Soil—A Review. Online. Sustainability. 2020, roč. 12, č. 21. ISSN 2071-1050. Dostupné z: https://doi.org/10.3390/su12219074. [cit. 2024-05-13].
7. AZARI, Aala; VANOIRBEEK, Jeroen A.J.; VAN BELLEGHEM, Frank; VLEESCHOUWERS, Brent; HOET, Peter H.M. et al. Sampling strategies and analytical techniques for assessment of airborne micro and nano plastics. Online. Environment International. 2023, roč. 174. ISSN 01604120. Dostupné z: https://doi.org/10.1016/j.envint.2023.107885. [cit. 2024-05-13]