Ramanova spektroskopie

Rozptyl světla

Existují dva typy rozptylu světla, a to:

• Pružný rozptyl, nazývaný také Rayleighův rozptyl, je jev, při kterém má rozptýlené světlo stejné vlastnosti a energii jako původní (iniciační) světlo dopadající na vzorek. V praxi to znamená, že toto odražené záření má stejnou frekvenci, vlnovou délku a barvu jako iniciační záření.
• Nepružný anebo Ramanův rozptyl. K nepružnému rozptylu dochází, když má rozptýlené světlo jiné vlastnosti (frekvenci, barvu a vlnovou délku) než původní dopadající iniciační světlo.  Jev, který způsobuje změnu vlastností tohoto rozptýleného světla, se nazývá Ramanův jev.

Ramanův jev

Jak je zřejmé z názvu, Ramanův jev je klíčovým prvkem celé této analytické metody. Popisuje proces, který stojí za změnami vlastností rozptýleného záření ve srovnání se zářením iniciačním.

Iniciační záření si může "vyměňovat" energii s molekulou vzorku. Molekula (vazba) může v některých případech absorbovat energii ze záření, čímž způsobí excitaci a vibrace molekuly (vazby). V důsledku toho bude mít záření rozptýlené od této molekuly jiné vlastnosti než iniciační záření, protože část iniciačního záření byla molekulou absorbována. Je možný i opačný proces, kdy excitovaná molekula předá část své energie rozptýlenému záření.

Detekcí rozptýleného záření získáme informace, které nám umožní sestavit Ramanovo spektrum. Každý pík ve spektru odpovídá frekvenci světla absorbovaného vzorkem, které vyburcovalo molekuly vzorku k vibracím. Tyto vibrační frekvence jsou jedinečné pro určité typy molekul a vazeb, čímž tato spektra vytvářejí "chemický otisk prstu", který nám umožňuje identifikovat a kvantifikovat různé látky.

Pomocí Ramanovy spektroskopie můžeme analyzovat cokoli, k čemu dosáhne světlo laseru a co vykáže dostatečnou Ramanovskou aktivitu. To znamená, že dokáže analyzovat vzorek, který lze umístit na vzorkovací stanici, a to bez složitější přípravy daného analytu. Velikou výhodou je, že ji lze využít i k analýze vzorků, které jsou ve skle, uvnitř průhledných obalů nebo ve vodě.

Fluorescence

Abychom lépe pochopili Ramanovou spektroskopii a přiblížili také její omezení, musíme přiblížit také fluorescenci. Fluorescence je jev, při kterém molekula absorbuje fotony s vysokou energií a dostává se tak do elektronicky excitovaného stavu.  Když se molekula vrátí do původního stavu, vyzařuje fotony s nižší energií, a tedy vyšší vlnovou délkou.
Jedná se tedy o fundamentálně odlišný jev než Ramanův jev, ačkoli při obou dochází k vylučování fotonů molekulou.

Je zde však zásadní problém – detektory spektrometrů mezi těmito jevy nerozlišují a zachycují jak fluorescenci, tak Ramanův rozptyl. Rozdíl mezi těmito jevy je však ve spektrech zřetelný – zatímco Ramanovy pásy jsou zřetelné a nesou informaci o chemickém složení, fluorescence má široké pásy a překrývá Ramanovy pásy. Fluorescence je v moderních přístrojích potlačena počítačovým zpracováním dat. Optimálním způsobem potlačení fluorescence před měřením je ale výběr vhodného laseru. Tomu se budeme věnovat v kapitole níž. 

Aplikace Ramanovy spektrometrie

Ramanova spektroskopie využívá velmi často viditelné, UV nebo blízké IČ laserové záření. To nám umožňuje měřit látky přes jakýkoli druh obalu, kterým může procházet viditelné světlo – skleněné lahve, plastové průhledné obaly a dokonce i vodu. Jedná se také o nedestruktivní a bezkontaktní metodu bez nutnosti složité přípravy vzorku, takže je široce použitelná v obrovském množství odvětví – ve farmacii, forenzní vědě, celních a bezpečnostních kontrolách, vědě a výzkumu, při studiu historických děl, v archeologii a restaurování…

Laser

Vlnová délka laseru je klíčovým faktorem ovlivňujícím kvalitu dat. Řídí se hledisky jako je rezonance, fluorescence a absorpce vzorku. Výběr vhodné vlnové délky zajišťuje optimální excitaci a sílu signálu, čímž zvyšuje přesnost analýzy.

V počáteční éře Ramanovy spektroskopie byly rozšířeny světelné zdroje, jako jsou lampy a žárovky. Jejich nízká intenzita však představovala omezení, které vedlo ke snížení citlivosti a obtížím při dosahování přesné analýzy. Významný pokrok nastal v 60. letech 20. století se zavedením laserů. Laserové zdroje poskytovaly koherentní, monochromatické a soustředěné světlo, čímž tato omezení účinně překonaly.

Po položení základů laserů v Ramanově spektroskopii je dalším důležitým krokem pochopení, které lasery jsou nejvhodnější pro konkrétní aplikace.

Dělení laserů:

• Modré (488 nm) a zelené (532 nm) mají podobné vlastnosti – dosahují vysoké citlivosti, produkují málo tepla, ale excitují fluorescenci. Jsou velmi oblíbené v anorganické chemii – například při analýze uhlíkových nanomateriálů (CNT, grafen aj.). Ty nepodléhají fluorescenci, ale jsou velmi citlivé na teplo – jsou to ideální vzorky pro tyto lasery. Obecně je preferován zelený 532nm laser, protože je cenově dostupnější.
• Červený 633 nm laser je velmi oblíbený, protože má dobrý poměr mezi nízkou fluorescencí, dobrou citlivostí a nízkou cenou. Také produkuje málo tepla je ke vzorkům šetrný, proto se často používá na biologické vzorky.
• Pro barevné a organické vzorky se nabízí 785 nm laser – produkuje teplo, ale má dobrou citlivost a nízkou fluorescenci, což je v této aplikaci důležité.
• NIR (blízký infračervený) laser s vlnovou délkou 1064 nm má nízký výkon, ale nevzbuzuje fluorescenci, takže poskytuje dobrý poměr signálu a šumu i u vzorků, které produkují silnou fluorescenci. Je oblíbený například pro organické látky, pigmenty a některé biologické vzorky.

FT- vs disperzní Raman

Při disperzní Ramanově spektroskopii se používá difrakční mřížka, která rozptyluje Ramanovo záření na jednotlivé vlnové délky. Většinou se zde uplatňují lasery ve viditelném pásmu – 532 nm, 633 nm a 785 nm. Tyto lasery poskytují vetší intenzitu Ramanovho signálu, ale jsou náchylnější k tvorbě fluorescence. Obvyklými vzorky pro disperzní spektroskopii jsou anorganické látky, horniny a minerály.

FT Raman používá interferometr, který převádí signál na interferogram. Ten je, jak název napovídá, díky Fourierově transformaci zpracován do podoby Ramanova spektra. Velkou výhodou této techniky je, že díky interferometru lze analyzovat celé spektrum najednou, takže není třeba rozdělovat signál na jednotlivé vlnové délky. To odpovídajícím způsobem urychluje sběr dat. Při FT Ramanové spektroskopii se obvykle používá laser o vlnové délce 1064 nm, který zpravidla vykazuje velmi nízkou fluorescenci. Obvyklé aplikace jsou tam, kde dopředu nevíme jaké vzorky budeme měřit - typicky forenzní analýzy či kontrola kvalita a nebo tam, kde máme problém s fluorescencí vzorků - farmaceutický průmysl.